medios de cultivo definidos e indifinidos

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CD. ALTAMIRANO, GRO.

LICENCIATURA EN  BIOLOGÍA

MATERIA:

BIOTECNOLOGÍA

UNIDAD II

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES 

SUBTEMA:

2.1 MEDIOS DE CULTIVO

NOMBRE DEL ALUMNO:

LUIS ÁNGEL DAMASO ALVARADO

SEMESTRE Y GRUPO:

Vlll SEMESTRE “A”

NOMBRE DEL PROFESOR:

FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA

MICROPROPAGACIÓN

El cultivo  in vitro permite el crecimiento y desarrollo de material vegetal en recipientes que lo separan del ambiente exterior y lo mantienen en condiciones controladas y asépticas. Entre las diversas técnicas de cultivo in vitro, la  micropropagación consiste en la producción clonal de vegetales a partir, generalmente,  de ápices o explantos nodales de una planta madre. La gran producción de nuevas plantas se ve favorecida gracias al rápido crecimiento del  material vegetal in vitro y a la proliferación de  tallos durante los subcultivos. 

MEDIOS DE CULTIVO

Una parte importante del cultivo in vitro son los Medios de Cultivo ya que en ellos se encuentran las sustancias necesarias para el crecimiento y desarrollo de los tejidos vegetales. Un medio de cultivo es una solución acuosa en donde se encuentran disueltas sales minerales que aportan los elementos esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn, Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de carbono, generalmente la sacarosa, debido a la escasa actividad fotosintética de los tejido in  vitro. Además, el medio puede ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del Crecimiento.

Los medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o 100 veces (Soluciones Madre o Stock). En la solución madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre que no se produzcan problemas de precipitación. Algunos elementos, como el Fe, se utilizan en forma de quelatos para mantener su disponibilidad durante el cultivo.

Los medios de cultivo se pueden utilizar de forma líquida o con un agente gelificante como el agar.

Sales mineralesMS (Murashige and Skoog, 1962)         (g/l)

(NH4 )NO3 1.650

KNO3 1.900

CaCl2.2H2O 0.440 

MgSO4.7H2O 0.370 

KH2PO4 0.170

FeSO4.7H2O  0.0278

Na2EDTA. 2H2O 0.0372

MnSO4.H2O 0.0169

ZnSO4.7H2O 0.0086

H3BO3 0.0062

KI 0.00083

Na2MoO4.2H2O 0.00025

CuSO4.5H2O 0.000025

CoCl2.6H2O 0.000025

Mioinositol 0.100

Tiamina HCl 0.0001

Acido nicotínico 0.0005

Piridoxina HCl 0.0005

Glicina 0.002

Sales minerales DKW modificado (g/l)

(NH4)NO3 1.416 

Ca (NO3)2 3H2O 1.811  

(1.960 si es 4 H2O)

CaCl2 2H2O 0.147 

MgSO4 7H2O 0.74 

KH2PO4 0.258 

FeSO4 7H2O 0.00676 

Na2 EDTA 2H2O 0.0908 

K2SO4 1.56 

Mn SO4  H2O 0.0338 

Zn SO4 7H2O 0.0212 

BO3H3 0.0124 

KI 0.00166 

Na2MoO4 2H2O 0.0005 

Cu SO4 5H2O 0.00005 

Co Cl2 6H2O 0.00005 

Mioinositol 0.1

Tiamina H Cl 0.001

Ác. nicotínico 0.001

Piridoxina. HCl 0.001

Biotina D(+) 0.00001

Glutamina (base libre ) 0.001

L-Cysteína H Cl 0.001

Pantotenato de Ca 0.1

Micronutrientes  mg/L

FeSO4.7H2O 27,8
Na2EDTA 37,3
H3BO3 6,2
MnSO4.4H2O 22,3
ZnSO4.7H2O 8,6
Na2MoO4.2H2O 0,25
CuSO4.5H2O 0,025
CoCl2.6H2O 0,025
KI 0,83


Vitaminas   mg/L
myo- Inositol 100
Tiamina HCl 0,1
Acido nicotínico 0,5
Glicina 2, 0
Piridoxina HCl 0,5


                      g/L
Sacarosa 30
Agar 7.5






ELABORACIÓN DE SOLUCIONES MADRE DEL MEDIO DE CULTIVO MURASHIGE Y SKOOG
Para la realización del medio de cultivo MS se elaboran las siguientes
soluciones Madre:
Soluciones stock de nutrientes:
⁻ Stock de macronutrientes,
⁻ Stock de Calcio,
⁻ Stock de micronutrientes
⁻ Stock de hierro y EDTA,
Soluciones Stock de vitaminas
Soluciones Stock de Reguladores


http://ocw.uniovi.es/file.php/57/practicas/Cuaderno_Pract_Biotec_11_OCW.pdf

MEDIOS DE CULTIVOS QUÍMICAMENTE DEFINIDOS

Son medios de cultivo que se caracterizan por su composición química es decirque  se conoce exactamente la cantidad de cada uno de los compuestos que hay en el medio; se conocen tanto como (cualitativa y cuantitativamente) posteriormente se detallan algunos de los medios de cultivos.

Ejemplo: Knudson (1946)

El primer medio conocido es el adecuado para de orquídeas. Bastante pobre en sales

Macronutrientes
(NH4)2SO4	0.5 g/l
MgSO4	0.122 g/l
Ca(NO3)2	0.694 g/l
KH2PO4	0.250 g/l
Micronutrientes
KI	0.83 mg/l
H3BO3	0.056 mg/l
MnSO4.H2O	5.68 mg/l
MoO3	0.016 mg/l
CuSO4.5H2O	0.062 mg/l
FeSO4.7H2O	25.0 mg/l

Ejemplo: White (1963)

Es uno de los medios, si no el mas, diluido de que se dispone, y por lo tanto de uso complementario al MS. Se elaboró para cultivo de raíces de tomate.

Macronutrientes
Ca(NO3)24H2O	0.3 g/l
KNO3	0.08 g/l
MgSO4.7H2O	0.72 g/l
Na2SO4	0.2 g/l
NaH2PO4.H2O	0.019g/l
Micronutrientes
KCl	65 mg/l
KI	0.75 mg/l
H3BO3	1.3 mg/l
MnSO4.7H2O	7 mg/l
ZnSO4.7H20	3 mg/l
Na2MoO4.2H2O	0.25 mg/l
CuSO4.5H2O	0.025 mg/l
CoCl2.6H2O	0.025 mg/l
Na2.EDTA	37.3 mg/l

Ejemplo: B5 (Gamborg, 1970-1976)

Gamborg trabajó activamente en la elaboración de medios, a los que dio diferentes números. EL B5 fue formulado para cultivo de callo de soja.

Macronutrientes
(NH4)2SO4	0.134 g/l
KNO3	2.528 g/l
MgSO4.7H2O	0.246 g/l
CaCl2.aq	0.15 g/l
KH2PO4	0.15 g/l
Micronutrientes
KI	0.75 mg/l
H3BO3	3.0 mg/l
MnSO4.H2O	10 mg/l
ZnSO4.7H20	2.0 mg/l
Na2MoO4.2H2O	0.25 mg/l
CuSO4.5H2O	0.025 mg/l
CoCl2.6H2O	0.025 mg/l
Na2.EDTA	37.3 mg/l
FeSO4.7H2O	27.8 mg/l

http://yactivany.blogspot.mx/2012/03/tarea-1-medios-de-cultivos-definidos-e.html

Ejemplo: WPM (Lloyd y McCown 1980)

Se elaboró para el cultivo de tallos de plantas leñosas y arbustivas, tipos de plantas para las que está especialmente adaptado

Ejemplo:KM8p (Kao y Michayluk 1982)

Kao y Michayluk abordaron la dificultad de lograr la viabilidad los protoplastos cultivados in vitro, hasta entonces muy limitada, desde el punto de vista de la optimización del medio, y formularon varios; el más exitoso fue el KM8p. Su característica principal y distintiva de los medios hasta entonces formulados es la gran diversidad de nutrientes que contiene, muchos de ellos no esenciales para el desarrollo de las plantas, pero que si han resultado limitantes en el cultivo de sus cromoplastos.

MEDIOS DE CULTIVOS INDEFINIDOS (SUSTANCIAS NATURALES)

Son medios de cultivo de los cuales no es decisivo conocer la composición exacta.

Sustancia:

•  Extratos como ejemplo; levadura, malta, carne, patata, maíz, raíces y rizomas.Ejemplo: Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar)
• Jugos de frutas u hortalizas (sustancias naturales que son utilizadas como medio de cultivo); como ejemplo: (Naranja, banano, piña, tomate, patata, leche de coco, agua de coco etc.).
• Caseína hidrolizada, como por ejemplo: Su uso es desaconsejable por no poder darse una composición precisa del extracto añadido, pueden resultar útiles sólo en casos concretos.

Se denomina levadura a cualquiera de los diversos hongos microscópicos uni celularesque son importantes por su capacidad para realizar la descomposición mediantefermentación de diversos cuerpos orgánicos, principalmente los azúcares o hidratos de carbono, produciendo distintas sustancias.

Extracto de levadura 2,5 g

Triptonga 5,0 g

Dextrosa 1,0 g

Agar 15,0 g

Agua

Ejemplo: Preparación del Agar con extracto de malta

Extracto de Malta 10 g

Agar-Agar 15 g

Procedimiento: Se pesan los ingredientes y se mezclan en el matraz con 1000 ml de agua destilada. La suspensión se calienta y agita hasta que queden totalmente disueltos los ingredientes.

Ejemplo: Preparación del Agar con papa dextrosa

Papa 200 g

Agar-Agar 15 g

Dextrosa o glucosa 20 g

Levadura 2 g

Procedimiento: Pelar y poner a hervir la papa en 500 ml de agua destilada o purificada durante 10-15 min. El extracto se filtra y se adiciona más agua hasta ajustar 1000 ml para reponer lo que se evaporó. Se agrega los otros ingredientes y se calienta a fuego lento moviendo constantemente durante 1-2 min hasta que queden totalmente disueltos.

Ejemplo: Preparación de Agar con extracto de trigo, paja y malta

Semillas de trigo 400 g

Extracto de malta 10 g

Paja de trigo 100 g

Agar-Agar 15 g

Dextrosa 10 g

Procedimiento: Hervir el trigo en un litro de agua, dejando consumir el líquido hasta aproximadamente 500 ml, esto mismo se hace con la paja. Se filtran ambos extractos y se mezclan en un recipiente, se agrega los demás ingredientes y se le adiciona agua hasta ajustar un litro, esta suspensión se calienta hasta disolver todos los ingredientes.

Ejemplo: Medio de cultivo in vitro para orquídeas

 se utilizan 3 tomates maduros cortados en trozos
1 (plátano) maduro cortado en trozos
900 ml agua
100 ml agua de coco
4 tabletas de tiamina 300 mg (vitamina B1)
Grenetina o gelatina sin sabor

Ejemplo: Agar frijol lima

Frijol lima molido 100 g

Agar-Agar 20 g

Agua destilada para completar 1000 ml

Procedimiento: se remojan los frijoles (Phaseoluslimensis)por 30 minutos. Se hierven por 30 minutos a baño maría con suficiente agua; se filtra el agua a través de una gasa; se coloca el líquido nuevamente en baño maría, se agrega el agar y se agita el líquido hasta que el agar se disuelva, se restaura el volumen del líquido hasta 1000ml con agua destilada.

Ejemplo: Agar harina de maíz

Harina de maíz 20 g

Dextrosa 20 g

Agar 20 g

Agua destilada hasta completar 1000 ml

Ejemplo: Agar jugo V-8

Jugo V-8

Carbonato de calcio

Agar-Agar

Agua destilada

3.Variedad De Medios De Cultivo	Los medios de cultivo que se utilizan el laboratorio dependen del microorganismo que se pretende cultivar y de la finalidad de su cultivo. Puede hacerse una descripción global de los mismos atendiendo a su composición química, a su estado físico y la finalidad del cultivo. Como la distribución se hace atendiendo a diferentes criterios un medio de cultivo puede incluirse en más de una categoría.
Composición: definidos/indefinidos	3.1 Según su composición química Para preparar los medios de cultivo definidos o sintéticos (ej el medio de Koser para la utilización del citrato) se utilizan componentes de alta pureza, por lo que se conoce su composición química (cualitativa y cuantitativamente).
	Cuando no es decisivo conocer la composición exacta del medio de cultivo se utilizan medios indefinidos, naturales o complejos, como el Agar nutritivo preparados con mezclas de nutrientes como peptonas, extracto de carne, extracto de levadura, agar-agar, etc.
Estado físico: Líquidos/ sólidos/ semisólidos	3.2. Según su estado físico .  Los medios de cultivo sólidos(como el  TSA) contienen el agente solidificante (generalmente agar al 1,5-2%) y los medios de cultivo  líquidos (como el agua de peptona) no llevan adicionados agentes solidificantes; los medios de cultivo  semisólidos (como el  Agar de Hugh-Leiffsoncontienen el agente solidificante en menor concentración que los sólidos.
Finalidad: Ordinarios/ enriquecidos/ diferenciales/, selectivos/de enriquecimiento	3.3. Según su finalidad   Cuando se cultivan microorganismos que requieren nutrientes comunes, se utilizan medios de cultivo ordinarios (como el Agua de peptona): sus nutrientes permiten el crecimiento de gran número de microorganismos, pero no de los que requieren nutrientes particulares. Las bacterias mas exigentes nutricionalmente se cultivan en medios enriquecidos (como Agar chocolate  que es Agar nutritivo añadido del 10% de sangre calentada –hemolizada-): Contienen los nutrientes ausentes de los medios ordinarios, como por ejemplo  factores orgánicos de crecimiento.
	Cuando se pretende que el propio cultivo de la bacteria diferencie entre distintos tipos de bacterias se utilizan Medios de cultivo diferenciales (ej. Medio para la fermentación de la lactosa): algún componente del medio proporciona un cambio visible del cultivo si existen ciertas bacterias  (en el caso de la lactosa la acumulación de ácidos).
	Puede favorecerse la probabilidad de seleccionar cierta bacteria específica de una mezcla de ellas utilizando medios de cultivoselectivos o realizando un enriquecimiento de la bacteria que se pretende seleccionar, en detrimento de otras bacterias de la mezcla. Los Medios de cultivo selectivos (como el Agar Mac Conkey) son medios sólidos que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunas bacterias, pero permite el de otras. El Agar Mac Conkey contiene sales biliares antibacterianas pero permiten el crecimiento de las Enterobacterias cuyo hábitat natural (el intestino) contiene tales sales antibacterianas. El resultado es el crecimiento selectivo de las bacterias que resisten las sales biliares, entre ellas las enterobacterias. El efecto antibacteriano selectivo de algunos medios de cultivo permite su utilización sin aplicar laesterilización convencional
	Los  cultivos de enriquecimiento se realizan en medios líquidos (medios de cultivo de enriquecimiento), con alguna propiedad física o química que favorecen el desarrollo de un determinado tipo bacteriano, o se incuban bajo condiciones especiales: el desarrollo de los microorganismos celulolíticos se favorece en un medio de cultivo que contiene celulosa como único sustrato orgánico. Otros microorganismos no podrán crecer tan eficientemente. V.cholerae es una bacteria que tolera el pH alcalino, por lo que el Agua de peptona-alcalina (pH 11) permite el enriquecimiento de Vibrio cholerae de una muestra de heces
	Medio de Koser  (por litro) Fosfato sódico amónico 1,5 g Fosfato monopotásico 1,0 g Sulfato magnésico 0,2 g Citrato sódico 3,0 g	Agua de peptona (por litro) Peptona 10 g NaCl  5 g		TSA (Agar de triptona y soja;  por litro) Peptona de caseína 15 g Peptona de soja  4 g NaCl  5 g Agar 20 g

4. Composición de algunos medios de cultivo de uso común

Peptona	2g
Glucosa	10g
Azul de bromotimol	0.03g
NaCl	5g
K2HPO4	0.3g
Agar	2.5g
Peptona	10 g
NaCl	5 g
Lactosa	2 g
Púrpura de bromocresol	0,025 g

BIBLIOGRAFIA

http://ocw.uniovi.es/file.php/57/practicas/Cuaderno_Pract_Biotec_11_OCW.pdf

http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-i/pb-i-2-variedad.htm
http://yactivany.blogspot.mx/2012/03/tarea-1-medios-de-cultivos-definidos-e.html