TÉCNICAS DE HIBRIDACION

Southern blot

Una técnica que se utiliza para identificar y localizar secuencias de ADN en una mezcla compleja y que son complementarias a otro fragmento de ADN llamado sonda.

La técnica de hibridación o southern blot denominada así en honor a quien la desarrollo en 1975, se emplea para identificar fragmentos específicos de ADN en una mezcla compleja. Inicialmente se digiere el ADN que queremos estudiar con una o más encimas de restricción, las cuales cortan en puntos específicos de la secuencia, generando fragmentos de varios tamaños. Seguidamente, estos fragmentos se separan por su tamaño en una gel de agaroza empleando corriente eléctrica y luego se transfieren a una membrana de nylon. Para la detección del fragmento de interés en la membrana, utilizamos otro fragmento de ADN o ARN que se llama sonda y que contiene la secuencia complementaria al fragmento que queremos identificar. La sonda, se marca con un isótopo radiactivo, se agrega a una solución y se incuba con la membrana por varias horas. Este hibridización, hace que las sonda se adhiera la fragmento de ADN en la membrana el cual contiene las bases complementarias. Al exponer la membrana a una película de fotografía, podemos identificar el fragmento y establecer así si está o no está contenido en el ADN que estamos estudiando.

http://www.conocimientosweb.net/portal/term1578.html

TRANSFERENCIA (BLOTTING)

 

La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda ELECTROFORESIS Se separan las proteínas o los ácidos nucleicos en un gel de electroforesis Con proteínas se utiliza un gel de poliacrilamida Con ácidos nucleicos se utiliza un gel de agarosa TRANSFERENCIA (BLOTTING) Se transfieren las bandas de proteínas o de ácidos nucleicos desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (flechas azules) para que puedan reaccionar con la sonda radioactiva. AUTORRADIOGRAFÍA Se añaden Anticueros radiactivos contra una proteína o sondas radioactivas de ácidos nucleicos (con secuencia conocida). Se espera a que reaccionen (A). Se coloca la membrana de nitrocelulosa sobre una placa fotográfica y se revela (B). http://www.ehu.es/biomoleculas/isotopos/blot.htm Northern blot Una técnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.  Northern blot o análisis Northern es básicamente una prueba para detectar la presencia del ARN mensajero en un tejido en particular y la cual permite también determinar el tamaño de la trascripción de ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN en particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, generalmente de cADN o rARN del gen de interés.  http://www.conocimientosweb.net/portal/term1542.html Northern blot Una técnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda. Northern blot o análisis Northern es básicamente una prueba para detectar la presencia del ARN mensajero en un tejido en particular y la cual permite también determinar el tamaño de la trascripción de ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN en particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, generalmente de cADN o rARN del gen de interés.  Northertn Blot: Es similar a la técnica anterior, pero permite detectar RNA en vez de DNA (Innis yGelfand, 1990). En síntesis la técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y suposterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las moléculas de RNA sontransferidas y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Después de la hibridación con unasonda marcada (y posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en elgel indican la ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendomarcadores de RNA de tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los RNA que se hanidentificado. Así, la técnica permite conocer el tamaño preciso de un mRNA, luego del empalmetranscripcional. Además, sirve para identificar diferentes tipos de mRNA codificados por un mismogen y para determinar la cantidad y el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra unmRNA específico. Así, será posible determinar los niveles de actividad génica, por ejemplodurante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un período definido dela vida, o después de haber sido sometido a los organismos a diferentes estímulos fisiológicos (Russel, 1998).El Northern Blot es una técnica muy similar al Southern Blot que permite la identificación desecuencias específicas de RNA.La muestra de RNA a analizar no requiere fragmentación y se somete a electroforesis en geles deagarosa, donde las moléculas de RNA se separan desde mayor a menor tamaño.Una vez terminada la electroforesis, y sin teñir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro denitrocelulosa ó a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una sonda marcada, específicapara la secuencia que se desea identificar.Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cDNA, que reconocerá a la secuencia deRNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidosnucleicos.El nombre de la técnica deriva por analogía al Southern Blot. http://es.scribd.com/doc/7176351/Southern-Northern-Western-Blot

Southern Blotting

Northern Blot

Northern Blot

Southern blot

RESUMEN DE LA UNIDAD IIl

TECNICAS DE C.T.V

En esta unidad vimos las técnicas de cultivo de tejidos vegetales aplicaciones y procesos fisiológicos de las células vegetales para la propagación in vitro. Empezando la unidad vimos las generalidades las cuales son totipotencia celular(es la capacidad que tiene una celula para formar una planta nueva), desdiferenciación(es cuando un tejido especializado o diferenciado se convierte en tejido indiferenciado), rediferenciación(es cuando un tejido indiferenciado se convierte en tejido diferenciado o especializado), relación A/C “Skoog”(relación auxina/citocininas, se necesitan para la formación de tallos, hojas y raíces e in vitro generar callos) estos procesos importantes para la micro propagación de tejidos vegetales. La micro propagación es un proceso de clonación, principales aplicaciones al ctv., mejora genética, propagación masiva, plantas libres de patógenos, conservación de germoplasma, metabolitos secundarios e investigación etc., estas son las principales aplicaciones para la micro propagación, para que este proceso se lleve a cavo conlleva a dos posibles vías morfo genéticas las cuales son: organogénesis y embriogénesis. La organogénesis es un proceso de formación de órganos la cual puede ser directa e indirecta es de origen pluricelular. La embriogénesis es un proceso de formación de embriones que provienen de tejidos somáticos (hojas, tallos, raíce) en este proceso no hay fusión de gametos al igual puede ser directa e indirecta es de origen unicelular. Otro punto muy importante para la técnica en CTV, son plantas libres de patógenos la cual se realiza mediante el cultivo de meristemos estos son tejidos de crecimiento vegetal, están libres de fitopatogenos y enfermedades. Los meristemos determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos, posibilitan la micro propagación de diferentes especies vegetales, son ampliamente utilizados como explantes para la crio conservación y conservación de germoplasma. Se clasifican en meristemos apicales, meristemos secundarios, florales e intercelulares. La ventaja de esta técnica de cultivar meristemos es que están libres de fitopatogenos y enfermedades.  Otra técnica interesante es el cultivo de anteras y óvulos la cual consiste en cultivar anteras u óvulos para formar plantas haploides las cuales se usan  para la obtención de plantas diploides homocigotas o razas puras. Otro punto o técnica es la variación somaclonal que es todo cambio genético (mutación) que ocurre en el CTV, los aspectos que hacen que la planta cambie son el tiempo, callos y presión hormonal mediante la multiplicación. Otra técnica en CTV, es el cultivo de protoplastos que consiste en la fusión de protoplastos o células sin pared celular formando un hibrido somático. La fusión puede ser de distintas especies vegetales ejemplo protoplastos de papa con protoplastos de tomate. Desafortunadamente esta técnica fue reemplazada por la aplicación de agrobacterium. Otra de las técnicas de CTV, es la conservación in vitro la cual se refiere a la conservación de plantas in vitro. Para este proceso se llevan a cabo ciertos métodos  de conservación in vitro  los cuales son: con crecimiento (transferencia seriada), con metabolismo limitado (baja concentración de nutrientes), con metabolismo detenido (crio conservación o congelamiento) en esta fase de crio conservación la cual consiste en la conservación de material biológico a muy bajas temperaturas utiliza nitrógeno liquido para la conservación, el NL detiene el crecimiento vegetal de los meristemos a una temperatura menor a 185° C. aspectos importantes de la conservación in vitro la regeneración de plantas (por meristemos) y la viabilidad. La tasa de crecimiento esta controlada por ciertos factores: temperatura, luz, composición de los medios de cultivo, aumento en la presión osmótica, azucares, reguladores del crecimiento etc., etc. En esta unidad aprendí por lo menos la mayoría de las técnicas de cultivo de vegetales sus aplicaciones agronómicas, los métodos y procesos que se llevan a cabo en cada una de las técnicas, lo cual concluyo que se cumplió el objetivo de la unidad. 

CRIOCONSERVACION

CRIOCONSERVACIÓN DEL GERMOPLASMA

La crioconservación, que describimos a continuación, puede ser aplicada ventajosamente a la conservación de especies y variedades vegetales silvestres o cultivadas como alternativa a las colecciones y bancos de germoplasma clásicos (bancos de semillas, colecciones en campo). La crioconservación de plantas es un proceso consistente en la preparación, mantenimiento y preservación a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de –196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno líquido (NL). Este método de conservación de material vegetal presenta una serie de ventajas frente a otros sistemas de preservación de recursos filogenéticos: es un método rápido, sencillo, no altera la estabilidad genética del material y reduce sustancialmente el esfuerzo y los costes que representan el mantenimiento de colecciones de germoplasma vegetal in vivo o in vitro, al eliminar casi por completo la mano de obra y evitar los riesgos fitopatológicos y fisiológicos que habitualmente aparecen en el mantenimiento de los bancos de germoplasma vegetales. Hay que señalar el importante ahorro de espacio que supone mantener una colección de especies hortícolas o leñosas en pocos metros cuadrados en vez de en plantaciones de cientos o miles de metros cuadrados.

El elemento fundamental de la crioconservación es el NL que se almacena y mantiene en tanques especiales herméticos que permiten que se mantenga en estado líquido y se evapore muy lentamente, manteniendo una temperatura de –196 ºC. El NL es incoloro, inodoro y no combustible y está a una temperatura de –196 ºC a presión atmosférica, por lo que el contacto con los tejidos provoca el congelamiento del área. Es de fácil manejo pero, teniendo en cuenta que desplaza el oxígeno del aire, hay que tener cuidado al manipularlo, lo que se debe hacer en lugares bien ventilados.

El material vegetal a utilizar puede proceder de cualquier parte de la planta: meristemos, yemas, ápices, tallos, callos, embriones somáticos, etc. Debe ser selec-cionado de plantas sanas y, en el caso de proceder de material de cultivo in vitro, los parámetros de cultivo se deben optimizar antes de la crioconservación, ya que el éxito de éste proceso de conservación va a depender tanto de los tratamientos utilizados antes de someter al material al NL, como de los utilizados una vez recuperado el material del NL. Por lo tanto, es de extrema importancia poner especial atención en la composición de los medios de cultivo donde se incube el material vegetal antes y después de introducirlo en NL para su conservación [Sakai y cols., 1993, Cryopreservation of Plant Genetic Resources 6: 5-26]. Para la manipulación del material es necesario utilizar recipientes de materiales resistentes a las bajas temperaturas, como los crioviales de polipropileno, donde el material vegetal que queremos conservar se deposita antes de introducirlo en el NL. Estos crioviales, con capacidades entre 1,2 y 15,0 ml, tienen un sistema de cierre a rosca especialmente diseñado para soportar la rápida conversión del NL a gas, que tiene lugar a temperatura ambiente, conversión que de otro modo produciría la explosión del contenedor. Debido a la facilidad con que se evapora el NL, es necesario controlar su nivel dentro de los tanques donde se almacena, para reponer las pérdidas y mantener estable la temperatura a –196 ºC y así asegurar la perfecta conservación del material.

Según la bibliografía, existen dos métodos de conge-lación. Podemos hablar de un método de congelación lento, y un método de congelación rápido.

El método de congelación lento, también llamado método convencional de precongelamiento [Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470], consiste en someter el material a un descenso gradual de temperatura desde –10 ºC hasta –30 ºC ó –40 ºC antes de introducir el material en el NL. Esto puede realizarse bajando la temperatura a saltos térmicos relativamente amplios (5 ºC/5 min), o bien a saltos térmicos muy pequeños (0,5 ºC/5 min), siendo este último sistema mucho más lento y dando lugar a una bajada de temperatura aparentemente continua. En el método de congelación rápido o simple, el material vegetal se congela inicialmente a –40 ºC, para pasarlo posteriormente al NL.

En general, conviene disminuir el contenido de agua del material vegetal para reducir los efectos de la formación de hielo en la congelación. Para ello el material se deshidrata parcialmente antes de la congelación. Esta deshidratación previa se puede realizar con sustancias como el gel de sílice o medios con altos contenidos en glicerol o sacarosa. Así, se elimina un gran porcentaje del agua contenida en el material, teniendo en cuenta que la mayoría de los materiales mantienen su viabilidad si conservan entre el 16,5 % y el 20 % del agua existente inicialmente en fresco [Uragami y cols., 1990, Plant Cell Reports 9:328-331], siendo la determinación de la tolerancia a la deshidratación y los métodos que permiten alcanzarla uno de los objetivos más importantes en el estudio de la crioconservación.

Por lo tanto, el método de congelación, la deshidratación y la utilización de sustancias crioprotectoras, de las que hablaremos más adelante, son los recursos existentes para reducir al máximo los daños que se pueden producir en la célula durante el proceso de congelación. De forma resumida, aunque al formarse el hielo, ya causa por sí mismo daños celulares, estos daños se agravan debido a que se produce el fenómeno de recristalización, que consiste en que los cristales de hielo que se forman en el interior celular durante el proceso de congelación, se derriten y vuelven a formarse dando lugar a estructuras termodinámicamente más estables, es decir, cristales más grandes, con un efecto sumamente dañino ya que provoca una extensa destrucción de estructuras protoplasmáticas y la lisis celular.

En el sistema de congelación lenta, el hielo comienza a formarse desde el exterior hacia el interior celular. El agua sale hacia el exterior desde el citoplasma y la vacuola, lo que provoca una diferencia de potencial osmótico que causa un aumento de la concentración de soluto en el interior celular, y esto va en detrimento de la posibilidad de supervivencia de la célula. Desarrollar este sistema requiere un equipo complejo y de gran coste que controle la disminución gradual y exacta de la temperatura y el tiempo de permanencia del material en cada estadio térmico programado en el protocolo. En el caso del sistema de congelación rápida ocurre lo contrario: se forma hielo desde el interior celular al exterior. El agua entra y la diferencia de potencial osmótico provocada es menor que en el método lento, por lo que los daños celulares que ocasiona una alta concentración de solutos no son tan críticos, si bien los daños por formación de hielo persisten.

Aunque los métodos de congelación son variados, curiosamente casi todos los autores coinciden en que el proceso de descongelación debe realizarse de forma rápida para evitar la recristalización, siendo el método más habitual la inmediata introducción del material congelado en agua caliente a 38 ºC.

Para evitar los daños celulares se recurre generalmente al uso de crioprotectores. Los crioprotectores son sustancias de diferente composición (DMSO, glicerol o etilenglicol) que van a embeber y cubrir el material a conservar, protegiéndolo, al facilitar el paso de agua a través de la célula. Es decir, van a estimular la deshidratación celular antes de la congelación intracelular. Entran en la célula retrasando el proceso de congelación celular, disminuyendo los efectos osmóticos negativos de los solutos intracelulares. En los procedimientos en que se utilizan crioprotectores, el material se somete frecuentemente a pretratamientos como son la encapsulación-desecación o la vitrificación. El método de encapsulación-desecación fue desarrollado por primera vez por Fabre y cols. [1991, Cryoletters 11: 413-426] para ápices de Solanum plureja y consiste básicamente en envolver el material en una cuenta de alginato y, posteriormente, someterlo a desecación, como por ejemplo, usando gel de sílice, antes de introducirlo en el NL. En el método de vitrificación [Sakai y cols., 1990, Cryobiology 27: 657; Sakai y cols., 1991, Plant Physiology 137: 465-470; Sakai y cols., 1991, Plant Science 74: 243-248] se utilizan combinaciones de agentes protectores, como DMSO, glicerol y etilenglicol, a diferentes concentraciones para proteger el material, ya que las combinaciones de agentes protectores son más eficaces que la utilización de cualquier agente en solitario. Una de las mezclas más utilizadas es: DMSO al 1 %, etilenglicol al 1 %, y glicerol al 30 %, o bien, DMSO al 5 o 10%, glicerol al 5 o 10 % y sacarosa.

Para incrementar los efectos de la utilización de los crioprotectores, el material vegetal puede precultivarse en un medio que contenga altas concentraciones de azúcar. Los azúcares, reducirían el contenido hídrico de la célula disminuyendo así la formación de hielo intracelular. Por ello, el trabajo preliminar para la conservación en cada especie es determinar su tolerancia a la deshidratación y ajustar los sistemas o protocolos de congelación para obtener una elevada supervivencia y viabilidad del material crioconservado.

Con esta técnica pretendemos contribuir a la preservación de un valioso recurso fitogenético de Andalucía: las variedades autóctonas andaluzas de espárrago originarias de Huétor-Tájar en la Vega del río Genil en Granada. Estas variedades autóctonas están protegidas por una Denominación Específica de Calidad por el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación [BOE, 17 de Abril de 1997], pero la realidad es que están en peligro de desaparición por la competencia de variedades híbridas foráneas, ya que en la actualidad ocupan menos de un 10 % de la superficie cultivada de espárrago en la zona de Huétor-Tájar.

BIBLIOGRAFIA

http://www.encuentros.uma.es/encuentros98/crioconservacion.htm