TÉCNICAS DE HIBRIDACION

Southern blot

Una técnica que se utiliza para identificar y localizar secuencias de ADN en una mezcla compleja y que son complementarias a otro fragmento de ADN llamado sonda.

La técnica de hibridación o southern blot denominada así en honor a quien la desarrollo en 1975, se emplea para identificar fragmentos específicos de ADN en una mezcla compleja. Inicialmente se digiere el ADN que queremos estudiar con una o más encimas de restricción, las cuales cortan en puntos específicos de la secuencia, generando fragmentos de varios tamaños. Seguidamente, estos fragmentos se separan por su tamaño en una gel de agaroza empleando corriente eléctrica y luego se transfieren a una membrana de nylon. Para la detección del fragmento de interés en la membrana, utilizamos otro fragmento de ADN o ARN que se llama sonda y que contiene la secuencia complementaria al fragmento que queremos identificar. La sonda, se marca con un isótopo radiactivo, se agrega a una solución y se incuba con la membrana por varias horas. Este hibridización, hace que las sonda se adhiera la fragmento de ADN en la membrana el cual contiene las bases complementarias. Al exponer la membrana a una película de fotografía, podemos identificar el fragmento y establecer así si está o no está contenido en el ADN que estamos estudiando.

http://www.conocimientosweb.net/portal/term1578.html

TRANSFERENCIA (BLOTTING)

 

La técnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografía, y permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de proteínas o de ácidos nucleicos: Si se trata de proteínas, la técnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con radioactividad para identificar cuál es la banda que presenta la proteína que me interesa localizar Si se trata de DNA, la técnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (moléculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda Si se trata de RNA, la técnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (moléculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda ELECTROFORESIS Se separan las proteínas o los ácidos nucleicos en un gel de electroforesis Con proteínas se utiliza un gel de poliacrilamida Con ácidos nucleicos se utiliza un gel de agarosa TRANSFERENCIA (BLOTTING) Se transfieren las bandas de proteínas o de ácidos nucleicos desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (flechas azules) para que puedan reaccionar con la sonda radioactiva. AUTORRADIOGRAFÍA Se añaden Anticueros radiactivos contra una proteína o sondas radioactivas de ácidos nucleicos (con secuencia conocida). Se espera a que reaccionen (A). Se coloca la membrana de nitrocelulosa sobre una placa fotográfica y se revela (B). http://www.ehu.es/biomoleculas/isotopos/blot.htm Northern blot Una técnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.  Northern blot o análisis Northern es básicamente una prueba para detectar la presencia del ARN mensajero en un tejido en particular y la cual permite también determinar el tamaño de la trascripción de ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN en particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, generalmente de cADN o rARN del gen de interés.  http://www.conocimientosweb.net/portal/term1542.html Northern blot Una técnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda. Northern blot o análisis Northern es básicamente una prueba para detectar la presencia del ARN mensajero en un tejido en particular y la cual permite también determinar el tamaño de la trascripción de ese ARN mensajero. El procedimiento se hace transfiriendo todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa. La presencia de un ARN en particular se detecta hibridizando esta membrana con una sonda de ácido nucleico, generalmente de cADN o rARN del gen de interés.  Northertn Blot: Es similar a la técnica anterior, pero permite detectar RNA en vez de DNA (Innis yGelfand, 1990). En síntesis la técnica consiste en extraer el RNA de las células pertinentes y suposterior separación por tamaño mediante electroforesis en gel. Las moléculas de RNA sontransferidas y unidas al filtro, al igual que en el Southern blot. Después de la hibridación con unasonda marcada (y posterior a la detección según el método de marcaje utilizado), las bandas en elgel indican la ubicación de los tipos de RNA que sean complementarios a la sonda. Teniendomarcadores de RNA de tamaño adecuado, se puede conocer el tamaño de los RNA que se hanidentificado. Así, la técnica permite conocer el tamaño preciso de un mRNA, luego del empalmetranscripcional. Además, sirve para identificar diferentes tipos de mRNA codificados por un mismogen y para determinar la cantidad y el tejido específico (o tipo de células) en que se encuentra unmRNA específico. Así, será posible determinar los niveles de actividad génica, por ejemplodurante el desarrollo, o bien en distintos tejidos (o tipos celulares) durante un período definido dela vida, o después de haber sido sometido a los organismos a diferentes estímulos fisiológicos (Russel, 1998).El Northern Blot es una técnica muy similar al Southern Blot que permite la identificación desecuencias específicas de RNA.La muestra de RNA a analizar no requiere fragmentación y se somete a electroforesis en geles deagarosa, donde las moléculas de RNA se separan desde mayor a menor tamaño.Una vez terminada la electroforesis, y sin teñir el gel, los fragmentos se traspasan a un filtro denitrocelulosa ó a una membrana nylon, luego el filtro se incuba con una sonda marcada, específicapara la secuencia que se desea identificar.Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo cDNA, que reconocerá a la secuencia deRNA inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidosnucleicos.El nombre de la técnica deriva por analogía al Southern Blot. http://es.scribd.com/doc/7176351/Southern-Northern-Western-Blot